Probenahme und Aufbereitung

Probenahme

Auswahl der Probestelle

Die Stellen der Probenentnahme sollen in freifließenden Abschnitten liegen. Staubereiche und künstlich stark aufgeweitete oder vertiefte Bereiche sind zu meiden, da sich dort die Fließgeschwindigkeit oft erheblich verlangsamt, was zu Einschichtungen oder zur Sedimentation des Phytoplanktons führen kann. Die Beprobung von Brücken ist zulässig, sofern die strömungszugewandte Seite gewählt wird.

Folgende Gewässerbereiche sind für Probestellen nicht geeignet:

• künstliche Staubereiche in Zusammenhang mit Wasserkraftanlagen, Pegeln oder Schleusen
• Gewässerabschnitte direkt unterhalb von Staustufen
• vertiefte Bereiche wie z. B. Hafenbecken oder tiefe Schifffahrtsrinnen (Faustregel: ungeeignet, wenn um mehr als ein Drittel vertieft gegenüber der "normalen" Tiefe)
• künstlich aufgeweitete Bereiche (Faustregel: ungeeignet, wenn auf mehr als das Doppelte aufgeweitet gegenüber der "normalen" Breite)

Beprobungstermin

Für jedes Untersuchungsjahr ist eine monatliche Beprobung des Phytoplanktons im Zeitraum März bis Oktober durchzuführen. Es sollten mindestens vier Termine im Zeitraum Mai bis September liegen und letztlich mindestens sechs Termine für die biologische Bewertung zur Verfügung stehen.

Eine 14-tägige Beprobung wird für die Chlorophyll-a-Bestimmung und für die Nährstoffe empfohlen.

Probenahme

Die Proben sollten in der Strommitte mit einem Wasserschöpfer (Ruttner- oder Van-Dorn-Fallschöpfer) in der Regel aus einer Tiefe von 0,5 m entnommen werden. Dies kann z. B. von einer Brücke aus auf der strömungszugewandten Seite geschehen. Es werden keine Planktonnetze verwendet.

In langsam fließenden Fließgewässern kann es zu horizontalen Einschichtungen des Phytoplanktons im Wasserkörper kommen.

Bei sichtbaren Aufrahmungen von Algen und einer Sichttiefe unter 1 m wird eine zweite Probe von der Gewässeroberfläche entnommen und mit der Probe aus 0,5 m zu einer Mischprobe vereint.

An jedem Probenahmetermin sind für die PhytoFluss-Bewertung aus der Potamoplankton-Schöpf­probe aus 0,5 m Tiefe mindestens folgende drei Teilproben herzustellen:

1. Chlorophyll a-Probe: 0,5-2 Liter (je nach Algendichte) unfixiert in PET-Flaschen, Transport ins Labor dunkel und kühl. Dort Weiterbehandlung.
2. Phytoplanktonprobe: Lugol-fixiert für die Analyse nach der Utermöhl-Methode, Gefäß: 100 ml-Klarglas-Enghalsflaschen, im Labor: bei gekühlter und luftdichter Lagerung mindestens für ein halbes Jahr haltbar.
3. Diatomeenprobe (Plankton) für die spätere Herstellung eines Diatomeenpräparats. Die Wahl der Fixierungsmethode sollte sich an den erforderlichen Lagerzeiten und –möglichkeiten orientieren, s. hierzu Abschnitt "Aufbereitung der planktischen Diatomeenprobe".

• • Variante "Filterprobe"(empfohlen): 1 Liter (je nach Algendichte) unfixiert in PET-Flasche, Transport ins Labor dunkel und kühl. Dort Filtrierung. Bei mobiler Filtriermöglichkeit (Handfiltriergerät): 100-1.000 ml Probe (je nach Algendichte, deutliche Färbung des Filters erforderlich) werden über Cellulosenitrat-Membranfilter (0,4-1,0 µm) filtriert. Die Filter werden in Plexiglas-Petrischalen gelagert und müssen bis zur endgültigen Lagerung noch Luft getrock­net werden.
  • Variante "Alkoholprobe" (empfohlen): Die Vorfixierung der Probe erfolgt vor Ort mit 96%igem Ethanol (unvergällt) oder Isopropanol. 0,9 Liter Probe wird in eine 1 Liter Kautexflasche gefüllt und mit Alkohol aufgefüllt, d. h. im Verhältnis 1:9 vorfixiert. Weiteres Einengen und Nachfixieren findet im Labor statt.
  • Variante "Lugolprobe": 500 ml Probe (je nach Algendichte oder Notwendigkeit einer Rückstellprobe auch 200-1.000 ml möglich) wird mit handelsüblicher Lugol-Lösung (versetzt mit Natriumacetat) in 500 ml-Klarglas-Enghals-Flaschen fixiert bis die Probe cognacfarben ist (ca. 4 ml Lugol pro 200 ml Probe). Zunächst keine Weiterbehandlung im Labor, bei gekühlter und luftdichter Lagerung mindestens für ein halbes Jahr bis maximal ein Jahr haltbar.

Alle Proben werden mit einem Etikett beschriftet, das jeweils den Namen des Gewässers und der Probestelle, das Probenahmedatum sowie möglichst auch eine fortlaufende Labor-Probennummer angibt. Es sollte sichergestellt sein, dass die unfixierten Proben noch am selben Tag zur Filtration im chemischen Labor eingehen.

Abb. 1: Links: Glasflasche mit Lugol-fixierter Probe; Rechts: geeichte Absetzkammer mit verschieden großen Aufsätzen (Foto: IGB).

Aufbereitung der Proben

Bearbeitung der Chlorophyll-a-Proben im Labor

Die Chlorophyll a-Konzentration (Chl a) einer Wasserprobe ist spektralphotometrisch zu messen. Sie korreliert mit der Biomasse des enthaltenen Phytoplanktons, da alle Arten dieses Pigment zur Photosynthese nutzen. Die Chlorophyll a-Konzentration wird für das PhytoFluss-Verfahren als Kenngröße für die Biomasse des Phytoplanktons verwendet.

Die Wasserproben müssen noch am Probenahmetag mit einer Vakuumpumpe auf einen Glasfilter filtriert werden (Abbildung 2). Der Filterrückstand enthält die Algen und deren Pigmente.

Abb. 2: Laboreinrichtung zur Filtration von Chlorophyll-a Proben auf Glasfaserfilter (Foto: IGB)

Die Bestimmung der Chlorophyll a-Konzentration nach der Norm (DIN 38409-H60 2019) beruht auf der ethanolischen Heißextraktion aus dem Filterrückstand und der anschließenden Absorptionsmessung bei 665 nm, wobei auch Phaeopigmente (Abbauprodukte des Chlorophyll) mit erfasst werden. Nach quantitativer Überführung des Chlorophyll a in Phaeopigmente mittels Ansäuern wird eine erneute Messung bei 665 nm durchgeführt. Eventuell auftretende Trübungen werden durch Messungen bei 750 nm korrigiert. Aus den photometrischen Analyse-Ergebnissen kann der Chlorophyll a-Wert nach DIN (mit Phaeophytinabzug) errechnet werden:

Chl a DIN = Gesamtpigment – (Phaeophytin/1,7)

Die Angabe der Pigmentkonzentrationen erfolgt üblicherweise in µg/l.

Aufbereitung der Phytoplanktonprobe (Utermöhl-Methode)

Ziel der mikroskopischen Analyse sind die taxonomische Bestimmung sowie repräsentative Vermessungen der Algenzellen zur Ermittlung des Biovolumens der Phytoplanktontaxa. Dies erfolgt an speziellen Umkehrmikroskopen nach dem genormten "Utermöhl-Verfahren" (DIN EN 15204). Dafür werden die Phytoplankter einen Tag zuvor in Absetzkammern angereichert (s. Abb. 1).

In einem definierten Volumen der Lugol-fixierten Probe werden die Taxa bestimmt und gezählt. Der Volumenbezug dient der Rückberechnung auf die im Gewässer herrschende Algendichte "Biovolumen/Liter". Anschließend wird ihr Verdrängungsvolumen, das sogenannte Biovolumen, unter Berücksichtigung ihrer unterschiedlichen Größen und Formen berechnet. Weitere Festlegungen, wie etwa zur mikroskopischen Bearbeitung und Auswertungsstrategie, wurden u. a. von Nixdorf et al. (2010) getroffen.

Für die Mikroskopie werden die Phytoplankter einen Tag zuvor in Absetzkammern angereichert. Da die Zellkonzentration in Abhängigkeit von der Artenzusammensetzung und der Saison sehr stark schwanken kann, sind Orientierungswerte zur Auswahl des benötigten Absetzvolumens sowie die Chlorophyll a-Konzentration der Probe hilfreich. In der Verfahrensanleitung (Mischke et al. 2022) sind Beispiele mit Orientierungswerten genannt.

Aufbereitung der Diatomeenprobe (pelagische Diatomeen) für PhytoFluss

Für die weitere Konservierung oder Weiterverarbeitung der Proben stehen je nach Fixierungsmethode im Gelände mehrere Varianten zur Verfügung. Die Wahl der passenden Methode richtet sich auch danach, wie lange die Probe bis zur endgültigen taxonomischen Bearbeitung gelagert werden muss.

Variante "Filterprobe": Zeitnah zur Probenahme bzw. möglichst am selben Tag ist das in der Regel 1 Liter unfixierte Probenvolumen auf Cellulosenitrat-Membran­filter zu filtrieren. Nach anschließender Lufttrocknung (s. auch Nixdorf et al. 2010) können die Filter in Plexiglas-Petrischalen ohne Konservierungsmittel längere Zeit aufbewahrt werden.

Anmerkung: Celluloseacetatfilter haben sich nicht bewährt, da diese beim späteren Aufschluss unter heißer Säure und H₂O₂ verklumpen. Ebenfalls ungeeignet ist die Verwendung von Glasfaserfiltern. Diese hinterlassen beim späteren Aufschluss eine hohe Zahl von Glasfasern, die das mikroskopische Bild überlagern und damit eine zuverlässige Bearbeitung im Mikroskop unmöglich machen.

Diese Art der Konservierung ist für Lagerzeiten bis deutlich über ein Jahr geeignet.

Variante "Alkoholprobe": Das vorfixierte Probenmaterial muss im Labor 2-3 Tage in der Kautexflasche absedimentieren. Der Überstand wird anschließend vorsichtig mit einer Wasserstrahlpumpe abgesaugt. Der aufgeschüttelte Rückstand wird in dicht schließende Flaschen abgefüllt und mit 96%igem Ethanol/Isopropanol (unvergällt, d. h. kein Brennspiritus!) im Verhältnis 1:5 nachfixiert. Ein Gesamtvolumen von 100 ml Diatomeen-Suspension ist ausreichend. Zur taxonomischen Bestimmung muss ein Diatomeenpräparat mit Probenaufschluss mittels Wasserstoffperoxid angefertigt werden (siehe Variante 2 in Nixdorf et. al. 2010; S. 14-15).

Diese Art der Konservierung ist für Lagerzeiten bis rund 6 Monate geeignet. Kühlung (4-8°C) verlängert die mögliche Lagerzeit.

Variante "Lugolprobe": Sind nur Lugol-fixierte Proben verfügbar, muss das jodhaltige Fixierungsmittel vor dem Aufschluss der Diatomeen folgendermaßen ausgewaschen werden: Die Proben werden mindestens 2 Tage zur Absedimentierung stehen gelassen. Der Überstand wird mit einer Wasserstrahlpumpe abgesaugt und mit H₂O dest. auf ca. 250 ml aufgefüllt. Dieser Auswaschvorgang wird noch zweimal wiederholt. Anschließend kann die Probe zur Analyse aufgeschlossen werden (Verfahren s. auch Nixdorf et. al. 2010).

Diese Art der Konservierung ist mit Kühlung (4-8°C) für Lagerzeiten von 6 Monaten bis maximal ein Jahr geeignet. Lugol-fixierte Proben dürfen nicht in Plastikflaschen aufbewahrt werden, da das Jod des Fixiermittels von der Flaschenwandung aufgenommen wird und die Fixierung dann abgeschwächt ist. Zudem kann die Kontrolle der Färbung der Probe (Cognac-farben) wegen der Durchfärbung der PE-Flaschenwände nicht mehr stattfinden.

Falls die Diatomeen-Bestimmungen nicht ohnehin obligatorisch erfolgen, entscheiden über deren Durchführung die in der Utermöhl-Zählung gefundenen Anzahlen von Taxa und Indikatortaxa des gesamten Jahrgangs. Dieses Prozedere mit fakultativer Diatomeen-Analyse nach Abschluss der Utermöhl-Taxonomie erfordert in der Praxis eine Haltbarkeit der Diatomeenproben, die deutlich über einem Jahr liegen kann.