Probenahme & Aufbereitung 

Zeitpunkt der Probenahme 

In Fließgewässern der Mittelgebirge und des Norddeutschen Tieflandes erfolgt die Probenahme im Idealfall gemeinsam mit der Kartierung und Probenahme der Makrophyten und des Phytobenthos ohne Diatomeen (PoD) in den Monaten Juli und August nach mehrwöchig stabilen hydrologischen Bedingungen. Wird die Probenahme der Diatomeen unabhängig von den anderen beiden Teilkomponenten durchgeführt, kann sie in der Zeit von Juli bis September erfolgen. In Gewässern mit alpinem Abflussregime stellt der Spätwinter den besten Zeitraum dar. In versauerten Bächen der Mittelgebirge wird die Probenahme zwei bis vier Wochen nach der Schneeschmelze durchgeführt, um die Zustände bei höchster Säurebelastung zu erfassen.

Material für die Probenahme

  • Topographische Karten 1:25.000 bzw. 1:50.000
  • GPS-Gerät
  • Exemplar der Handlungsanweisung
  • Feldprotokoll
  • Schreibmaterialien (Bleistifte)
  • Wathose
  • Weithalsflaschen oder -gläschen
  • vorgefertigte Etiketten und/oder wasserfeste Stifte zur Beschriftung der Probengefäße
  • Zahnbürste, Teelöffel, Spatel o. ä.
  • Ethanol (96 %)
  • Fotoausrüstung
  • Sicherheitsausrüstung

Vor der Probenahme sind die Probengefäße sorgfältig mit einem wasserfesten Stift zu beschriften oder einem dauerhaft haltbaren Etikett zu bestücken. Die Beschriftung muss eine spätere Zuordnung von Probengefäß, Diatomeensuspension und Dauerpräparat gewährleisten und sollte folgende Angaben umfassen:

  • Codierung (eindeutige Kennung, die den Bezug zu Begleitinformationen herstellt)
  • Gewässername
  • Probestelle (eindeutige Benennung)
  • beprobtes Substrat
  • Datum der Probenahme
  • Probenehmer

Durchführung der Probenahme

Der Diatomeenbewuchs wird als Mischprobe von den vorhandenen Bodensubstraten in möglichst repräsentativen Anteilen entnommen. Dies gilt für strukturell ungestörte wie auch für durch Verbauung degradierte Fließgewässer mit anthropogen eingebrachten Substraten.

Die Probe ist in einer dauerhaft von Wasser überfluteten Tiefenzone zu entnehmen, um das Einbringen von aerophilen Arten zu vermeiden, die an wechselfeuchte Bedingungen angepasst sind. Dies gilt insbesondere für Gewässer mit kurzzeitig stark schwankenden Abflüssen und für Schifffahrtsstraßen.

Die Diatomeenprobenahme findet vor den Begehungen der Makrophyten- und PoD-Kartierung statt, um das Probenmaterial aus einem möglichst ungestörten Bereich entnehmen zu können. Die Probenahme ist möglichst schonend durchzuführen, um die Bestände des PoD und der Makrophyten nicht zu schädigen.

Die Begehung erfolgt entgegen der Fließrichtung. Es ist darauf zu achten, dass innerhalb des Untersuchungsabschnittes keine Zuflüsse oder Drainagen einmünden. Bei kleineren Gewässern ist der gesamte Gewässerquerschnitt zu beproben. Die Maßnahmen der Arbeitssicherheit sind grundsätzlich bei allen Probenahmen einzuhalten.

In Abhängigkeit vom Gewässertyp können die vorhandenen Substrattypen von Hartsubstraten (Blöcke, Steine) bis hin zu Sand und Weichsedimenten reichen, die in unterschiedlicher Weise beprobt werden.

Probenahme von Hartsubstraten

Die Bewuchsdichte auf Hartsubstraten kann in Abhängigkeit vom Gewässertyp und des Probenahmezeitpunktes sehr unterschiedlich sein. Nicht selten ist der Diatomeenbewuchs makroskopisch nicht erkennbar, kann aber durch Betasten der Substratoberfläche erfühlt werden. Bei der Probenahme werden mindestens zehn Steine in ursprünglicher Ausrichtung vorsichtig von Hand entnommen. Der Bewuchs wird mit einer Zahnbürste geeigneter Härte, einem Teelöffel oder einem Spatel flächig abgekratzt und in ein beschriftetes Weithalsprobengefäß überführt. Bei Gebrauch von Zahnbürsten sind diese wegen der hohen Gefahr von Verschleppungen von Diatomeen nur einmalig zu verwenden oder zwischen zwei Probenahmen in einem Ultraschallbad gründlich zu reinigen.

Probenahme von Sand, Kies und Weichsediment

Gut entwickelte Diatomeengesellschaften sind als makroskopisch sichtbarer Bewuchs anhand ihrer braunen Pigmentierung oder einer puddingartigen bis locker flockigen und dann zumeist auch voluminösen Struktur erkennbar. Der Bewuchs ist am besten mit einem Löffel vorsichtig abzuheben, in horizontaler Aufwärtsbewegung durch das Wasser zu führen und in ein beschriftetes Weithalsprobengefäß zu überführen. Alternativ ist die Handbeprobung, bei der mit einer scherenartigen Schließbewegung von Mittelfinger und Ringfinger der horizontal über das Substrat gleitenden Hand der Bewuchs auf die Handfläche gebracht und vorsichtig aus dem Wasser gehoben wird. Beide Methoden eignen sich in Wassertiefen bis ca. 1 m, abhängig von der Körpergröße und Armlänge des Probenehmers. Für die Entnahme aus größeren Tiefen bieten sich verschiedene Saug- oder Pumpsysteme an.

Bei Sandsubstraten und Weichsedimenten ist grundsätzlich darauf zu achten, dass nur die obersten Millimeter entnommen werden. Dadurch wird der Zeitaufwand für die Präparation verkürzt und der Anteil der sich bei der mikroskopischen Analyse im Dauerpräparat störend auswirkenden Fremdpartikel vermindert

Um eine für die Auswertung ausreichende Diatomeenmenge sicherzustellen, sollte nach Absetzen im Probengefäß mindestens 5-10 ml Diatomeensediment vorliegen.

Fixierung

Die Fixierung der Probe erfolgt vor Ort, spätestens aber am Abend des Probenahmetages durch Zugabe von Ethanol in einer Endkonzentration von ca. 60 %.

Feldprotokoll

Die Dokumentation der Probenahme und der Gegebenheiten vor Ort ist eine wichtige Grundlage für die spätere Auswertung und Interpretation der Ergebnisse. Ein speziell auf die Diatomeenprobenahme abgestimmtes und standardisiertes Kartierprotokoll steht unter „Weiterführender Literatur“ als Download zur Verfügung – ebenso Versionen für kombinierte Untersuchungen mit den Teilkomponenten Makrophyten und/oder Phytobenthos ohne Diatomeen.

Die Lage der Probestelle ist möglichst genau in eine topographische Karte des Maßstabes 1:25.000 oder 1:50.000 einzutragen, aus der später die Rechts- und Hochwerte der Probestelle ermittelt werden können. Alternativ können die Koordinaten mittels eines GPS-Gerätes direkt erfasst werden. In diesem Fall sollten Anfangs- und Endpunkt des Untersuchungsabschnittes so genau wie möglich festgehalten werden. An jeder Probestelle sind mindestens zwei Fotografien (gewässeraufwärts und -abwärts) anzufertigen.

Aufbereitung im Labor

Die lichtmikroskopische Bestimmung von Diatomeen erfolgt anhand der arttypischen Strukturen des Kieselsäureskelettes, das im lebenden Zustand von organischen Zellbestandteilen überdeckt wird. Vor der taxonomischen Auswertung müssen diese durch Oxidation (z. B. mit starken Säuren oder Wasserstoffperoxid) entfernt werden. Zurück bleibt eine Diatomeensuspension, die von störenden organischen Zellbestandteilen und weiteren organischen Komponenten befreit ist. Die Aufbereitung mit Salz- und Schwefelsäure wird hier empfohlen, da das PHYLIB-Verfahren auf Grundlage dieser Präparationsmethode entwickelt und geeicht wurde und ein hoher Reinheitsgrad der Präparate resultiert. Alternativ kann die Aufbereitung mit Wasserstoffperoxid (siehe unten) durchgeführt werden.

Zur Analyse im Lichtmikroskop werden anschließend Dauerpräparate hergestellt, die bei fachgerechter Lagerung über viele Jahrzehnte hinweg haltbar sind.

Säurepräparation

Die Säurepräparation besteht aus zwei Schritten, dem Kochen mit Salz- und mit Schwefelsäure oder Wasserstoffperoxid  wobei giftige Gase entstehen. Die in der Folge beschriebene Ausführung ist daher unter einem leistungsfähigen und säurebeständigen Abzug mit der gebotenen Vorsicht und unter Einhaltung der Arbeitsschutzmaßnahmen durchzuführen. Schutzkleidung und Augenschutz sind obligatorisch. Bei allen Arbeitsschritten ist streng darauf zu achten, dass keine Verschleppung der mikroskopisch kleinen Diatomeenschalen zwischen verschiedenen Proben stattfinden kann. Alle Arbeitsgeräte sind daher nach Kontakt mit einer Probe sorgfältig unter fließendem Leitungswasser zu reinigen. Aufgrund der erforderlichen Sedimentationszeiten müssen zur Durchführung der Säurepräparation ca. 14 Tage veranschlagt werden.

1. Schritt: Kochen mit verdünnter Salzsäure
Dauer 30 Minuten
(bei stark kalkhaltigen Proben bis zu 60 Minuten)

 

Stielchen und Gallerten der Zellen werden aufgelöst und die Kieselsäureschalen vom Substrat (z. B. Sandkörner) getrennt. Zudem wird die Bildung von Gips bei der sich anschließenden Schwefelsäure-Behandlung verhindert.

2. Schritt: Kochen mit konzentrierter Schwefelsäure oder Wasserstoffperoxid
Dauer bis zu 8 Stunden
(je nach Gehalt an organischem Material)

Oxidation der organischen Bestandteile in der Probe

Für die Säurepräparation werden folgende Materialien benötigt:

Chemikalien

  • Salzsäure 25% z. A.
  • Schwefelsäure 95-97% z. A.
  • Kaliumnitrat z. A.

Weitere Ausstattung

  • Abzug
  • Heizplatte
  • Schutzkleidung (Laborkittel, Schutzbrille, säurebeständige Laborhandschuhe)
  • Bechergläser (hohe Form, Fassungsvermögen mindestens 150 ml)
  • Uhrgläser mit Durchmesser entsprechend den Bechergläsern
  • Becherglaszange
  • Siedestäbchen
  • ggf. Mörser und Pistille zum Zerreiben des Kaliumnitrats
  • Spatel
  • kleines Kunststoffsieb mit Durchmesser entsprechend den Bechergläsern
  • Universal-Indikatorpapier zur pH-Wert-Bestimmung
  • Aqua dest.
  • Spritzflasche
  • Rollrandgläschen oder Schraubgläschen mit Dichtung zur Aufbewahrung der Suspensionen (Volumen mindestens 10 ml)
  • beschriftete Etiketten für Suspensionsgläschen

 Vorbereitende Arbeiten zur Säurepräparation sind:

  • Bechergläser für eindeutige Zuordnung mit Bleistift beschriften
  • bei hohem Wasseranteil der Probe das Material 24 Stunden absetzen lassen und anschließend überschüssiges Wasser vorsichtig abdekantieren
  • Probe durch Schütteln gut mischen und ca. 20 ml in Becherglas überführen
  • Sichern eines Teils des verbleibenden Materials als Rückstellprobe

Kochen mit Salzsäure Probe mit 20 - 40 ml verdünnter Salzsäure versetzen

  • Probe mit 20 - 40 ml verdünnter Salzsäure versetzen
  • Vorsicht: Bei kalkhaltigen Proben kann es anfänglich zu einer starken Schaumentwicklung kommen, in diesem Fall die Salzsäure zunächst schrittweise in kleinen Mengen zugeben.
  • Probe auf der Heizplatte zum Kochen bringen und ca. 30 Minuten kochen. Weist die Probe einen hohen Sandanteil auf, kann es zu Bewegungen der Bechergläser auf der Heizplatte kommen. In diesem Fall muss die Position der Bechergläser auf der Heizplatte regelmäßig korrigiert werden.
  • Nach Erkalten der Probe grobe Substratreste durch ein Kunststoffsieb absieben und das Becherglas mit Leitungswasser auffüllen
  • Probe stark aufrühren um Sand, Kies und kleinere Steine soweit wie möglich zu entfernen und nach einer maximal einminütigen Sedimentationszeit vorsichtig abdekantieren
  • Probe 24 Stunden sedimentieren lassen
  • Der sich anschließende Waschvorgang besteht aus dem vorsichtigen Abdekantieren auf etwa ein Drittel des Probevolumens, dem Auffüllen mit Leitungswasser und einer mindestens 24-stündigen Sedimentationszeit. Der Waschvorgang wird insgesamt viermal durchgeführt.
  • (Alternativ kann die Probe zwischen den Waschvorgängen in einer Tischzentrifuge etwa 10 Minuten lang bei maximal 2000 Umdrehungen pro Minute abzentrifugiert und der wässrige Überstand auf etwa ein Drittel abdekantiert oder mit der Wasserstrahlpumpe entfernt werden. Diese Vorgehensweise erlaubt eine schnellere Aufbereitung, ist aber arbeitsintensiver und birgt die Gefahr insbesondere langschalige Diatomeen zu zerbrechen.)

Kochen mit Schwefelsäure

  • Probe durch Abdekantieren auf einen geringen Wasseranteil einengen und mit 20 - 30 ml konzentrierter Schwefelsäure versetzen
  • Becherglas mit einem Siedestäbchen versehen, einem Uhrglas abdecken und auf der Heizplatte zum Kochen bringen
  • In Abständen von etwa 20 Minuten mit einem Spatel eine Prise Kaliumnitrat zugegeben bis sich die Probe weiß entfärbt oder eine schwach grau bis gelbliche Farbe annimmt. Bei geringen Mengen organischer Bestandteile sind bereits wenige Zugaben von Kaliumnitrat ausreichend, bei einem hohen Anteil kann der Kochvorgang bis zu acht Stunden dauern.
  • Probe nach dem Farbumschlag 20 Minuten auf der ausgeschalteten Heizplatte belassen und dann auf einer glatten, säurebeständigen Arbeitsfläche weiter abkühlen lassen. Nach dem Abkühlen der Probe und dem Absetzen der Diatomeen bilden diese einen weißen bis gräulichen Bodensatz.
  • Anschließend werden die Proben gewaschen bis der Neutralpunkt erreicht ist. Dazu wird die Probe vorsichtig auf etwa ein Drittel ihres Volumens abdekantiert und mit Leitungswasser aufgefüllt. Die Sedimentationszeit zwischen den Waschvorgängen sollte mindestens 24 Stunden betragen. Vorsicht: Beim ersten Wässern der Probe nach dem Kochvorgang ist mit großer Vorsicht vorzugehen, da es zu heftigen Reaktionen kommen kann. Das Erreichen des Neutralpunktes ist mit pH-Papier zu überprüfen. Zumeist ist mindestens achtmaliges Waschen erforderlich. Der letzte Waschvorgang erfolgt mit destilliertem Wasser.
  • Suspension im Becherglas durch Schütteln gut durchmischen und in ein beschriftetes Gläschen überführen

Kochen mit Wasserstoffperoxid 

Alternativ zur Oxidation mit Schwefelsäure und Kaliumnitrat kann auch Wasserstoffperoxid als Oxidationsmittel eingesetzt werden. Vorsicht: Der Reaktionsprozess kann sehr dynamisch verlaufen und erfordert Arbeitserfahrung und strenge Beaufsichtigung.

  • Probe durch Abdekantieren auf einen geringen Wasseranteil einengen und mit 10 - 20 ml Wasserstoffperoxid versetzen
  • Becherglas mit Inhalt langsam und vorsichtig auf der Heizplatte erhitzen bis Gasentwicklung einsetzt, vorsichtig bis zum Kochen weiter erhitzen, Überschäumen verhindern
  • Kochprozess ca. 15 - 30 Minuten fortsetzen, bis sich die Probe weiß bis grau entfärbt. Bei einem hohen Anteil organischer Substanzen kann der Kochvorgang bis zu einer Stunde dauern.
  • Diatomeensuspension im Becherglas auf einer glatten, oxidationsbeständigen Arbeitsfläche weiter abkühlen lassen. Nach dem Abkühlen der Probe und dem Absetzen der Diatomeenschalen bilden diese einen weißen bis gräulichen Bodensatz.
  • Anschließend werden die Proben zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen und der wässrige Überstand abzentrifugiert oder nach der Sedimentation des Diatomeenmaterials abdekantiert, um Reste des Wasserstoffperoxids zu entfernen. Die Sedimentationszeit zwischen Waschvorgängen sollte mindestens 24 Stunden betragen.
  • Niederschlag im Zentrifugenglas bzw. Becherglas durch Zugabe von destilliertem Wasser und Schütteln gut durchmischen und in ein beschriftetes Gläschen überführen

Herstellen von Dauerpräparaten

Zur Herstellung von Dauerpräparaten wird die Diatomeensuspension nach dem Eintrocknen in Kunstharz (Naphrax) eingebettet. Die Präparate sind bei sachgemäßer Lagerung dauerhaft haltbar, können in einer Belegsammlung archiviert und auch nach vielen Jahrzehnten noch ausgewertet werden.

Materialien

  • Deckgläser (empfohlen werden runde Deckgläser mit Durchmesser 18 mm, alternativ können rechteckige Deckgläser ca. 18 x 24 mm verwendet werden)
  • Haushaltsspülmittel
  • Kosmetiktücher
  • Pipetten
  • Aqua dest.
  • Uhrgläser (Durchmesser entsprechend der Becherglasgröße)
  • Deckglaspinzette oder rundgebogene Pinzette
  • Objektträger (Kanten geschliffen)
  • Bunsenbrenner oder Heizplatte
  • Abzug
  • Naphrax1
  • Beschriftete Etiketten für Objektträger
  • Präparatekasten oder -mappe

1 Naphrax wird vom englischen Hersteller ohne Zugabe von Toluol versendet. Um die für die Präparateherstellung dünnflüssige Konsistenz herzustellen, muss anhand der beigefügten Anleitung vor Gebrauch Toluol zugesetzt werden. Bei häufigem Gebrauch und/oder unzureichendem Verschluss wird Naphrax zähflüssig und muss durch erneute Zugabe von Toluol verdünnt werden. Im deutschen Handel wird seit einigen Jahren auch gebrauchsfertiges toluolfreies Naphrax angeboten und kann hier bezogen werden.

Von großer Wichtigkeit ist eine einheitliche und haltbare (!) Beschriftung der Objektträger und Suspensionsgläschen. Sie dient den Zwecken der Qualitätssicherung, ermöglicht die Herstellung weiterer Präparate zu einem späteren Zeitpunkt und ist Bestandteil der archivierten Diatomeensammlungen der Bearbeiterinnen und Bearbeiter. Die Beschriftung sollte folgende Angaben umfassen:

  • Gewässer
  • Probestelle
  • Codierung (Kennung, die den Bezug zu möglichen Begleitinformationen herstellt)
  • Datum der Probenahme
  • Beprobte Substrate (optional)
  • Bearbeiter (taxonomische Auswertung)

Auftropfen der Diatomeensuspension

  • Deckgläschen durch kurzes Eintauchen in heißes, stark spülmittelhaltiges Wasser reinigen und anschließend abtrocknen
  • Diatomeensuspension durch Schütteln des Gläschens gut durchmischen und kurz (maximal 30 Sekunden) sedimentieren lassen
  • Mit einer sauberen Pipette eine geringe Menge aus dem oberen Zentimeter der Suspension entnehmen und auf das Deckgläschen auftropfen. Um Konvektionen zu vermeiden, ist der Tropfen möglichst flach zu halten. Stark konzentrierte Suspensionen (deutliche Färbung) vor dem Auftropfen mit destilliertem Wasser in einem Uhrgläschen verdünnen und die verdünnte Suspension vor dem Auftropfen durch Füllen und Entleeren der Pipette gut durchmischen
  • Um Kontaminationen zu vermeiden, Pipetten und Uhrgläschen vor der Behandlung verschiedener Proben unter fließendem Wasser gut reinigen
  • An der Luft erschütterungsfrei und staubgeschützt trocknen lassen

Einbetten in Naphrax

  • Fettfreien Objektträger mit beschriftetem Etikett versehen
  • Einen Tropfen Naphrax auf den Objektträger aufbringen
  • Deckgläschen mit einer Pinzette aufnehmen und mit der beschickten Seite nach unten auf das Naphrax auflegen. Dabei ist darauf zu achten, dass das Deckgläschen erst über dem Naphraxtropfen nach unten gewendet wird.
  • Um das Lösungsmittel auszutreiben, den Objektträger über einem Bunsenbrenner bei kleiner Flamme erhitzen, bis das Naphrax etwa 5 bis 10 Sekunden Blasen wirft. Alternativ kann das Lösungsmittel auf einer Heizplatte bei 100oC ausgetrieben werden. Mit Hilfe einer Pinzette prüfen, ob das Deckglas fest mit dem Objektträger verbunden ist und ggf. nochmalig erhitzen bis das Lösungsmittel vollständig ausgetrieben ist
  • Objektträger sofort auf einer glatten Arbeitsfläche lagern und abkühlen lassen
  • Nach Abschluss der Präparateherstellung der Diatomeensuspension 5 bis 10 Tropfen Glycerin zugeben, um ein Eintrocknen bei der langfristiges Lagerung zu verhindern
  • Suspensionsgläser in einer Sammlung archivieren

Eine optimale Diatomeendichte im Präparat liegt vor, wenn nach Durchmustern eines vollständigen Transsektstreifens die erforderliche Zahl von Diatomeenobjekten (siehe „Mikroskopische Auswertung“ unter „Bestimmung“) gezählt ist. Dies trägt der Tatsache Rechnung, dass auf dem Deckglas durch Konvektionen im Suspensionstropfen eine teilweise Entmischung stattfinden kann. So können bei starken Konvektionsströmen kleinschalige, leichte Diatomeen in der Deckglasmitte konzentriert sein, während sich große, schwere Schalen überproportional häufig in den Randbezirken finden.

Konservieren der Diatomeensuspension

Um Bakterien- oder Pilzbefall zu verhindern, wird die verbleibende Suspension nach der Herstellung der Dauerpräparate durch Zugabe von 3 ml Ethanol dauerhaft konserviert. Schließt sich die Präparateherstellung nicht unmittelbar an die Säureaufbereitung an und wird die Suspension zunächst mittel- bis langfristig gelagert, erfolgt die Zugabe von Ethanol direkt im Anschluss an die Säurebehandlung. Um ein Eintrocknen der Suspension zu verhindern, können vor der abschließenden Archivierung fünf bis zehn Tropfen Glycerin zugegeben werden. Vor der Fertigung neuer Dauerpräparate muss dieses jedoch wieder ausgewaschen werden.